隨著制藥企業(yè)對生物治療藥物的日益重視,在藥物研究中使用lcms定量分析蛋白和多肽藥物已經(jīng)引起越來越多研究者的興趣。艾塞那肽是一種治療性多肽,目前已被批準用于治療i型和ii型糖尿病。艾塞那肽可增強胰腺β細胞分泌葡萄糖依賴性胰島素,以調(diào)節(jié)糖代謝和胰島素分泌。

近年來,血漿中艾塞那肽的濃度測定主要通過配體實驗來完成,例如利用酶標免疫測定法進行艾塞那肽的 藥代動力學(xué)研究。但是,由于某些具有相似理化性質(zhì)的化合物的存在,致使酶標免疫測定法缺乏足夠的特異 性和選擇性,導(dǎo)致采用該方法分析將面臨一定的風(fēng)險?；谝陨显?采用ab sciex qtrap®5500系統(tǒng)的 mrm3模式確保分析血漿中多肽藥物時能夠達到更高的選擇性。

實驗方法

樣品制備:提取人血漿中的艾塞那肽,用氮氣吹干,復(fù)溶。在所有的操作步驟中,ph值及有機相都要嚴格控制。

串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在藥物高通量篩選和生物分析中的應(yīng)用

液相色譜條件:uhplc采用shimadzu uflc lc-20acxr;反相色譜柱為c-18 2.0 x30mm,5μ;流速為 0.6ml/min;進樣體積為5 μl;流動相a為含0.1%甲酸的水溶液,流動相b為含0.1%甲酸的甲醇溶液;梯度5分 鐘,流動相b濃度從2%升至95%。

質(zhì)譜條件:使用ab sciex qtrap® 5500系統(tǒng)中的mrm3掃描模式進行l(wèi)c/ms分析。開啟離子阱的動態(tài)填充時間(dft)功能,在10,000da/s的掃描速度下進行ms3掃描。總周期時間為0.17s。采用質(zhì)荷比 838→396→202進行mrm3分析。qtrap® 5500系統(tǒng)進行mrm3分析原理展示在圖2中。

圖1. 艾塞那肽結(jié)構(gòu)。艾塞那肽是由39個氨基酸組成的多肽(mw =4186.6 da),是糖代謝和胰島素分泌的調(diào)節(jié)劑。

圖2. mrm3定量分析工作原理。首先在q1四極桿中選擇母離子,然后在q2碰撞池中碎裂,其子離子在線性離子阱中富集并分離,接著通過激發(fā)產(chǎn)生第二級碎片,然后將第二級產(chǎn)物離子掃描至檢測器。

實驗結(jié)果

在增強全掃描模式(ems)下,選擇多電荷母離子[m+5h]5+838.3作為前體離子(母離子,圖3,上左 圖)。當前體離子碎裂后,選擇m/z 396.4為*級子離子(增強子離子掃描(epi),圖3,上右圖)。* 級子離子m/z 396.4在阱內(nèi)進一步碎裂產(chǎn)生ms3質(zhì)譜(圖3,下圖),選擇其中主要的碎片離子m/z 202.2作為 ms3定量的第二級子離子。

艾塞那肽檢測結(jié)果

使用mrm3方法后,顯著提高了人血漿中艾塞那肽分析方法的選擇性。圖4展示出了mrm3方法與傳統(tǒng)的 mrm定量方法所得結(jié)果的對比,mrm3方法結(jié)果中基線更低,完全消除了血漿中的內(nèi)源性干擾。qtrap® 5500 快速的掃描速度(10,000da/s)可使分析物的色譜峰有足夠的采集點,從而使定量結(jié)果具有很好的重現(xiàn)性。

如表1中所示,mrm3方法顯著改善lloq及qc的分析結(jié)果,6次連續(xù)進樣分析的準確度及cv%證明: mrm3方法具有很好的定量性能,完全適用于生物分析。

圖3. mrm3實驗設(shè)計。 ems掃描(上左圖)后選擇豐度高的母離子,然后使用epi掃描以識別出*強的碎片離子(上右圖),*后采用ms3掃描選擇*佳第二級碎片進行提取。

圖4. mrm3檢測方法顯著提高血漿中化合物檢測的選擇性。 進行血漿中艾塞那肽檢測時,mrm3模式可通過消除色譜干擾、降低背景噪音來改善loq。

結(jié)論

更好的線性(r2=0.996)。

表1:mrm3方法檢測的準確度和重現(xiàn)性。質(zhì)量控制樣品的重復(fù)性結(jié)果表明:mrm3分析與驗證的生物分析相一致。

串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在藥物高通量篩選和生物分析中的應(yīng)用

圖5. 使用mrm和mrm3方法檢測人血漿中艾塞那肽的標準曲線。 mrm3(右圖)的線性范圍是5-1000ng/ml,相對mrm(左圖)的250-1000ng/ml,mrm3方法明顯具有

1. mrm3分析方法可以成功應(yīng)用于人血漿中艾塞那肽生物分析。

2. mrm3分析能夠提高生物分析方法的選擇性,消除基線噪音及色譜干擾,與傳統(tǒng)的艾塞那肽mrm分析結(jié)果相比體現(xiàn)了卓越的分析性能。

3. mrm3分析結(jié)果顯示其可獲得從5-2000ng/ml濃度范圍內(nèi)優(yōu)異的標準線性。相比較,傳統(tǒng)的mrm方法的

線性濃度范圍為250-1000ng/ml。

4. mrm3方法檢測的準確度和重現(xiàn)性完全符合生物分析實驗的要求。

參考文獻:

1. mrm3 quantitation for highest selectivity in complex matrices. ab sciex technical note, publication 0920210-01.

多肽藥物

http://www.absciex.com.cn/applications/drug-discovery-and-development-mass-spec/biopharma-in-china

液相色譜

http://www.absciex.com.cn/products/hplc-products

lcms

http://www.absciex.com.cn/products/mass-spectrometers/qtrap-systems/ab-sciex-qtrap-6500-lcmsms-system